Слюна - это биологическая жидкость, секретируемая тремя парами крупных слюнных желез (околоушных, подчелюстных и подъязычных) и многими малыми слюнными железами. Секрет слюнных желез дополняют компоненты сыворотки крови, интактные или разрушенные клетки слизистых оболочек, иммунные клетки, а также интактные или разрушенные микроорганизмы ротовой полости. Все это определяет слюну как сложную смесь разнообразных компонентов. Слюна играет важную роль в формировании приобретенного зубного налета на поверхности зубов, а благодаря смазочному эффекту участвует в поддержании целостности слизистой оболочки рта и верхних отделов ЖКТ. Слюна также играет важную роль в физико-химической защите, антимикробной защите и заживлении ран ротовой полости. Многие компоненты слюны и их взаимосвязь, включая белки, углеводы, липиды и ионы тонко регулируются при выполнения биологических функций слюны. Нарушение сложного сбалансированного состава слюны приводит к повреждению слизистой оболочки рта и зубов.
Многие изменения физико-химических свойств слюны представляют диагностический интерес и используется для скрининга и ранней диагностики некоторых локальных и системных нарушений.
Химический состав слюны
Неорганические компоненты слюны
|
Компонент |
Слюна, выделяющаяся между приемами пищи |
Стимулированная |
|
В пределах 8.0 |
||
|
Бикарбонаты |
В пределах 40-60 мМ/л |
|
|
В пределах 100 мM/л |
||
|
В пределах 70 мM/л |
||
Вода является преобладающепй составляющей слюны (~ 94%). Значение рН слюны в покое слегка кислый, который изменяется между рН 5,75 и 7,05, с увеличением скорости потока слюны повышается до рН 8. Кроме того, рН также зависит от концентрации белков, ионов бикарбоната (НСО 3) и фосфата (PO 4 3-), которые имеют значительную буферную емкость. Концентрация бикарбоната составляет ~ 5-10 мМ / л в состоянии покоя, и может увеличиться до 40-60 ммоль / л при стимуляции, тогда как концентрация фосфата составляет ~ 4-5 мМ / л независимо от скорости потока. Кроме бикарбоната и фосфата в слюне присутствуют другие ионы. В целом поддерживается слегка гипотоническая осмолярность слюны. Наиболее важными являются ионы натрия (1-5 мМ / л в покое и 100 мМ / л при стимулировании), хлорид (5 ммоль / л в покое и до 70 мМ / л при стимулировании), калий (15 мМ / л в покое и 30-40 мМ / л при стимулировании) и кальций (1,0 мМ/ л в покое и 3 4 мМ / л при стимулировании). В более низких в слюне содержатся аммоний (NH 4 +), бромид, медь, фторид, иодид, литий, магний, нитрат (NO 3 -), перхлорат (ClO 4 -), тиоцианат (SCN-) и др.
Таблица 2 - Белки слюны
|
Белки, секретируемые железами |
Белки сывороточного происхождения |
Белки иммунных клеток |
Бактериальные, неизвестные и смешаннные |
|
Альфа-амилаза |
Альбумин |
Миелопероксидаза |
Альфа1-макроглобулин |
|
Белки групп крови |
Альфа-антитрипсин |
Кальпротектин |
Цистеин пептидаза |
|
Цитостатины |
Факторы свертывания крови |
Катепсин G |
|
|
Эпидермальный фактор роста |
Белки фибринолитической системы |
Дефензины |
|
|
Эластаза |
Калликреин |
||
|
Гистатин Лактоферрин Пероксидаза Белки, богатые пролином Статгерин |
Иммуноглобулины |
Ингибитор протеаз Фибронектин Слюнные шапероны Hsp70 Стрептококковый ингибитор |
Ферменты слюны:
- альфа-амилаза
- мальтаза
- язычная липаза
- лизоцим
- фосфатаза
- карбоангидраза
- калликреин
- РНКаза
- ДНКаза
- Цистеин пептидаза
- Эластаза
- Миелопероксидаза
- Проферменты - факторы свертывания крови и системы фибринолиза
Углеводы слюны
В слюне присутствует значительное количество гликопротеинов. В молекулах некоторых белков углеводная часть составляет до 80% - муцины, но обычно - 10-40%. Наиболее важными компонентами являются аминосахара, галактоза, манноза и сиаловые кислоты (N-ацетилнейраминовая кислота). Углеводные цепи муцинов преимущественно содержат кислые сульфаты и остатки сиаловой кислоты; цепи со свойствами антигенов групп крови содержат примерно равные количества 6-дезокси галактозы, глюкозамина, галактозамина и галактозы. Другие обычные ингредиенты углеводных цепей N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин и глюкуроновая кислота. Общее количество углеводов, содержащихся в слюне составляет 300-400 пг / мл, из которых количество сиаловой кислоты, как правило, около 50 пг / мл [до 100 пг / мл].
Наиболее важная функция углеводов в составе белков - увеличение вязкости слюны, предотвращение протеолиза, предотвращение выпадения кислых осадков (растворимых в кислоте антигенов групп крови, муцина).
Липиды слюны
Слюна содержит от 10 до 100 мкг/ мл липидов. Наиболее частыми липидами в слюне являются гликолипиды, нейтральные липиды (свободные жирные кислоты, сложные эфиры холестерина, триглицериды и холестерин), несколько меньше фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, сфингомиелин и фосфатидилсерин) . Липиды слюны в основном железистого происхождения, но некоторые из них (такие, как холестерин и некоторые жирные кислоты), диффундируют непосредственно из сыворотки. Основными источниками липидов являются секреторные везикулы, микросомы, липидные плоты и другие липиды плазмы и фрагменты внутриклеточных мембран лизированных клеток и бактерий. Большая часть слюнных липидов связывается с белками, особенно с гликопротеинами высокой молекулярной массой (например, муцином). Липиды слюны могут играть определенную роль вформировании зубного налета, слюнных конкрементов и образовании кариеса зубов.
Реакции гидролитического расщепления молекул крахмала протекают с участием особых ферментов.
Поступающие в организм человека сложные углеводы пищи имеют иную структуру, чем углеводы человеческого тела. Так полисахариды, составляющие растительный крахмал, - амилоза и амилопектин – представляют собой линейные или слаборазветвленные полимеры глюкозы, а крахмал человеческого тела – гликоген, - имея в основе те же глюкозные остатки, образует из них иную – сильноразветвленную – полимерную структуру. Поэтому усвоение пищевых олиго– и полисахаридов начинается с их гидролитического расщепления в процессе пищеварения до моносахаридов.
Гидролитическое расщепление углеводов в процессе пищеварения происходит под действием ферментов гликозидаз, расщепляющих 1-4 и 1-6 гликозидные связи в молекулах сложных углеводов.
К гликозидазам относятся амилаза слюны, поджелудочного и кишечного соков, мальтоза слюны и кишечного сока, конечная декстриназа, сахараза и лактаза кишечного сока. Гликозидазы активны в слабощелочной среде и угнетаются в кислой среде.
Расщепление крахмала (и гликогена) начинается в полости рта под действием амилазы слюны. Слюна – это сложная биологическая жидкость, участвующая в поддержании гомеостаза полости рта. В полости рта находится не чистый секрет слюнных желез, а так называемая смешанная слюна, или ротовая жидкость. Она представляет собой суммарный секрет всех слюнных желез, включает также микрофлору, содержимое десневых карманов, десневую жидкость, лейкоциты, остатки пищевых продуктов.
Слюна содержит белки: амилазу, лизоцим, альбумины, глобулины и муцин. Содержащийся в слюне фермент амилаза может превращать полисахарид крахмал в дисахарид мальтозу.
Реактивы и оборудование: 1%-ный раствор крахмала, слюна, раствор Люголя, пробирки, фильтры, фильтровальные воронки, спиртовка, спички, держатель для пробирок, термостат, пипетки.
Ход работы.
В 2 пробирки наливаем по 10мл 1%-ного раствора крахмала, в первую добавляем 2мл профильтрованной слюны, во вторую – 2мл профильтрованной и предварительно прокипяченной слюны. Обе пробирки помещаем в термостат при 38-40ºС. Через каждую минуту отбираем из пробирок по 1-2мл жидкости, смесь охлаждаем, добавляем по 1-2 капли раствора Люголя.
Наблюдения. Пробы из одной пробирки сначала имеют синее окрашивание, потом красное, а последующие – желтоватую окраску. Под действие ά-амилазы при гидролитическом распаде крахмала образуются декстрины (С6Н10О5)n разной сложности, которые с иодом дают разное окрашивание:
Схема гидролиза крахмала
Амилодекстрин → эритродекстрин → синее окрашивание красное окрашивание
→ ά-ахродекстрин → γ-ахродекстрин → мальтодекстрин → мальтоза не дают специфического окрашивания, имеют желтоватую окраску
При добавлении иода в пробы, взятые из 2 пробирки, всегда наблюдается синий цвет раствора.
3. 2. Определение активности амилазы по Вольгемуту
Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющей весь добавленный крахмал.
Амилазная активность слюны выражается объёмом (в мл) 0,1% -ного раствора крахмала, который расщепляет 1 мл неразведенной слюны при температуре 38ºС в течении 30 мин. В норме активность слюны составляет 160-320 единиц.
Данный метод не требует специальной аппаратуры (ФЭК, спектрофотометр).
Реактивы и оборудование: слюна, дистиллированная вода, 1%-ный раствор крахмала, 1%-ный раствор иода, стеклянная палочка, 10 пробирок, термостат.
Ход работы.
В 10 пробирок наливаем по 1мл воды и в первую из них добавляем 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Перемешиваем содержимое этой пробирки и переносим 1 мл смеси во вторую пробирку. Содержимое второй пробирки также перемешиваем, переносим 1 мл смеси в третью пробирку и продолжаем так до 10-ой пробирки. Из десятой пробирки выливаем 1 мл смеси.
Во все пробирки добавляем по 1 мл воды и по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала, перемешиваем содержимое, встряхиваем пробирки и помещаем их в термостат при 38ºС на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждаем холодной водой, добавляем в них по 1 капле 0,1%-ного раствора иода и перемешиваем. Амилаза слюны (КФ 3. 2. 1. 1) катализирует реакцию:
При реакции с иодом жидкость в пробирках окрашивается в жёлтый (мальтоза), оранжевый (ахродекстрины), красный (эритродекстрины), фиолетовый (амилодекстрины) и синий (крахмал) цвета.
Полученные данные заносим в таблицу.
№ пробирки 1 2 3 4 5 6 7
в) 3 проба Светло-желтый Желт. Инт. -желт. Оранж. Красн. -бурый Фиолет.
Отмечаем последнюю пробирку с желтой окраской, в которой гидролиз крахмала прошел полностью, и делаем расчеты.
а)слюна курящего человека до обеда – пробирка № 4. В этой пробирке содержится 1/160мл неразведенной слюны.
Составляем пропорцию:
1/160мл слюны расщепляет 2мл 0,1%-ного раствора крахмала,
Х = 2·1/1/160 = 320
Следовательно, 1мл неразведенной слюны расщепляет за 30мин при 38ºС 320мл 0,1%-ного раствора крахмала. Активность амилазы слюны записываем следующим образом:
А(38ºС/30мин) =320 единиц.
б)слюна некурящего человека до обеда – пробирка № 6. В этой пробирке содержится 1/640мл неразведенной слюны.
1/640мл слюны расщепляет 2мл 0,1-ного раствора крахмала,
1мл слюны расщепляет Хмл 0,1%-ного раствора крахмала
Х=1280, А(38ºС/30мин) =1280 единиц.
в)слюна курящего человека после обеда – пробирка № 5. В этой пробирке содержится 1/320мл неразведенной слюны.
1/320мл слюны расщепляет 2мл 0,1%-ного раствора крахмала,
1мл слюны расщепляет Хмл 0,1%-ного раствора крахмала,
Х = 640, А(38ºС/30мин) =640 единиц.
г) слюна некурящего человека после обеда – пробирка № 7. В этой пробирке содержится 1/1280мл неразведенной слюны.
1/1280мл слюны расщепляет 2мл 0,1%-ного раствора крахмала,
1мл слюны расщепляет Хмл 0,1%-ного раствора крахмала,
Х = 2560, А(38ºС/30мин) =2560 единиц.
3. Исследование действия на крахмал амилазы человека и животных
Источником амилазы человека будет служить слюна. Амилазы животного происхождения мы найдем в пчелином мёде.
Реактивы и оборудование: слюна, пчелиный мед, вода, жидкий крахмальный клейстер, настойка иода, раствор пищевой соды, уксус, пробирки, пипетки, стеклянные палочки.
Ход работы.
Приготовим 5 растворов. Первый раствор: собираем в пробирку около 0,5 мл слюны и разбавляем холодной кипяченой водой в 20 раз. Второй раствор: очень жидкий крахмальный клейстер (четверть чайной ложки крахмала на стакан воды). Третий раствор: разбавленная водой в 20 раз аптечная иодная настойка. Четвертый раствор: 2-3 капли пчелиного меда, разведенные водой в 10 раз и тщательно перемешанные. Пятый раствор: половина чайной ложки пищевой соды на 10 ложек воды.
Для проведения исследования берем 9 пробирок, во все наливаем около 5 мл клейстера. В пробирки 1,4 и 7 прибавляем пипеткой по 5 капель уксуса, а в пробирки 2,5 и 8 – столько же раствора соды. В остальные пробирки прибавляем по 5 капель чистой воды. Содержимое пробирок перемешиваем и в каждую вносим по 10 капель разбавленной слюны. Через 10 мин в пробирки 1,2 и 3 прибавляем 1-2 капли раствора иода и перемешиваем смесь. Наблюдаем за изменением окраски.
Еще через 15 мин прибавляем такую же порцию иода в пробирки 4,5 и 6, а ещё через 10 мин – в остальные пробирки. Крахмал и декстрины дают различную окраску с иодом, и по мере разрушения крахмала амилазой цвет меняется. Так можно судить не только о распаде крахмала, но и о том, какая среда – кислая, нейтральная или щелочная – более благоприятна для этого процесса.
Опыт с пчелиным медом ставим точно так же.
4. Ферментативный гидролиз крахмала
Предварительно готовим ферментные препараты ά- и β-амилаз.
Реактивы и оборудование: развивающиеся семена ячменя, дистиллированная вода, уксус, порошок мела, раствор крахмала, раствор иода, ступка, фарфоровый пестик, плотная ткань, стакан, водяная баня, 10 пробирок, пипетка.
Ход работы.
Развивающиеся семена ячменя растираем в ступке, кашицу разбавляем двойным количеством дистиллированной воды и отжимаем через плотную ткань в стакан. Такой экстракт содержит два фермента: альфа-амилазу и бета-амилазу. Дополнительной обработкой можно разрушить один из них, чтобы наблюдать действие другого.
Альфа-амилазу разрушим нагреванием. К одной части экстракта из ячменя добавляем смесь и нагреваем её 20 мин на водяной бане при 70ºС, тщательно перемешивая. Охлажденный раствор содержит бета-амилазу.
Чтобы получить раствор альфа-амилазы, нужно разрушить бета-амилазу кислотой. Около 5мл экстракта охлаждаем до 2-3ºС в холодильнике, прибавляем неполную чайную ложку охлажденного уксуса и доливаем в пробирку почти доверху холодную воду. Смесь перемешиваем и оставляем на 15-20мин, а затем нейтрализуем раствор, добавляя порошок мела до прекращения выделения пузырьков. Ещё раз размешиваем смесь, разбавляем в 2 раза водой, даем отстояться и сливаем жидкость над осадком в чистую пробирку. На этом подготовка к опыту закончена.
В 10 пробирок наливаем по 1 мл раствора крахмала и по 9мл воды. В пробирки 1-5 добавляем пипеткой 10 капель раствора альфа-амилазы, в остальные пробирки – столько же раствора бета-амилазы. Содержимое всех пробирок перемешиваем. Через 3 мин в пробирки 1и 6 прибавляем 1 каплю раствора иода и размешиваем. То же проделываем с пробирками 2 и 7 через 5мин, 3 и 8 – через 10мин, 4 и 9 – через 20мин, 5 и 10 – через 30мин.
Наблюдения: под действием альфа-амилазы крахмал расщепляется на декстрины, о чем мы судим по образованию характерной гаммы окрасок: фиолетовой, красно-бурой, красной, оранжевой, желтой. В присутствии ά-амилазы окраска быстро меняется.
В присутствии бета-амилазы декстрины не образуются, во всех пробирках наблюдается синяя окраска, интенсивность которой по мере расщепления крахмала уменьшается. Бета-амилаза как бы «откусывает» кусочки от молекул крахмала.
Результаты этого опыта наглядно показывают разнообразие свойств даже у похожих ферментов.
На основе выполненной работы можно сделать следующие выводы:
1. Исследуемая слюна содержит альфа-амилазу. При кипячении слюны альфа-амилаза распадается и крахмал не расщепляется.
2. Активность амилазы некурящего человека выше, чем у курящего человека. В слюне заядлых курильщиков амилазы содержится очень мало.
3. Крахмал и декстрины дают различную окраску с иодом, и по мере разрушения крахмала амилазой цвет меняется. Оптимум действия амилазы находится в пределах нейтральной реакции.
4. ά- и β- амилазы имеют различный характер действия. В живых организмах ферменты обычно действуют совместно.
5. Заключение
Слюна – превосходный объект для биохимического исследования, и притом, в отличие от большинства других объектов животного происхождения, постоянно доступный.
Биохимия – одна из интересных и практически значимых наук. Эксперимент в этом курсе играет роль источника знаний о веществах, входящих в состав живых организмов и их превращениях. Происходящие при этом превращения намного сложнее тех сравнительно простых реакций, которые мы наблюдали в пробирках. Но познание простого – это первый шаг к познанию сложного.
Исследование самого себя, собственной слюны, вносит дополнительный интерес в данную экспериментальную работу. Действительно, интересно обнаружить, что у тебя в ротовой полости работает биокаталитическая система.
Данные, полученные в ходе эксперимента, можно использовать при изучении некоторых разделов биологии (темы «Пищеварение. Пищеварительные ферменты») и химии («Углеводы. Метаболизм углеводов»).
Cтраница 1
Амилаза слюны гидролизует многие из х (1 - Ч) - глико-зидных связей в крахмале и в гликогене. При этом образуется смесь, состоящая из мальтозы, глюкозы и оли-госахаридов. Когда мы жуем сухари или крекеры, они становятся постепенно слаще, поскольку содержащийся в них безвкусный крахмал подвергается ферментативному гидролизу с образованием Сахаров.
Амилаза слюны является а-амилазой.
Амилаза слюны, действуя на амилопектин, дает ряд резистентных разветвленных олигосахаридов.
Амилаза слюны начинает свое действие в полости рта, но оно незначительно вследствие кратковременного пребывания здесь пищи. Гидролиз углеводов ферментами слюны продолжается в желудке, пока в глубокие слои его пищевого содержимого не проникает кислый желудочный сок, прекращающий действие карбогидраз и инактивирующий их.
Амилаза слюны и других источников теряет способность к перевариванию крахмала (при оптимальном рИ 6 8 этого фермента), если она диалпзована; активность возвращается при добавлении ионов хлора. Ионы брома обладают аналогичным, но более слабым эффектом; другие анионы активируют еще слабее.
Для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта споласкивают водой) и доводят водой до метки 10 мл.
Важнейшим ферментом слюны является птиалин - амилаза слюны, которая катализирует гидролиз крахмала до декстринов и частично даже до мальтозы. Окончательный гидролиз этих продуктов расщепления до глюкозы осуществляется в тонком кишечнике.
При пережевывании пища смешивается со слюной, и затем амилаза слюны в течение первых нескольких минут нахождения пищи в желудке вызывает превращение крахмала в мальтозу.
Так, хлористый натрий в разведенных растворах ускоряет действие амилазы слюны на крахмал. Растворы сернокислой меди, наоборот, сильно замедляют действие амилазы слюны.
Расщепление крахмала (и гликогена) начинается в полости рта под действием амилазы слюны.
Простым и наглядным примером, демонстрирующим действие ферментов и некоторые их свойства, является гидролиз крахмала под действием амилазы слюны. Поэтому, прежде чем перейти к изучению главнейших свойств ферментов на этом объекте, необходимо остановиться на гидролизе крахмала.
Так как амилоза представляет собой легко доступный линейный а-в - (1 - 4) - полимер глюкозы, который при гидролизе под действием амилазы слюны превращается в мальтозу и мальтотриозу, то она является идеальным исходным материалом для получения мальтотриозы. Реакционная смесь, полученная по этому методу, не содержит сложных олигосахаридов с а-и - (1 - 4) - или а-в - (1 - 6) - связями, как это имеет место при применении некоторых других методов. Мальтоза, образующаяся из амилозы под действием амилазы слюны, удаляется ферментацией пекарскими дрожжами. Из полученного раствора мальтотриозу выделяют адсорбированием на активном угле с последующим элюированием водным спиртом. Спиртовый раствор упаривают в вакууме до сиропа. Сироп высушивают в эксикаторе и получают аморфный продукт. При хро-матографировании раствора препарата на бумаге было получено одно пятно восстанавливающего сахара, соответствующее положению три-сахарида в ряду мальтоолигосахаридов.
Активность амилазы слюны выше всего при почти нейтральной реакции (рН 6 8) и подавляется как кислотами, так и щелочами.
Большинство ферментов обладает очень высокой специфичностью действия по отношению к определенным веществам (субстратам) или определенным типам химических связей. Так, амилаза слюны расщепляет крахмал, но не действует на другой полисахарид - целлюлозу. Для осуществления взаимодействия молекул фермента и субстрата, на который воздействует фермент, нередко необходимо участие неорганических ионов. Эти ионы выступают в роли активаторов ферментов.